Prologo

El presente Blog tiene como objetivo difundir e informar a alumnos de grado y posgrado, colegas veterinarios sobre distintas patologí­as hereditarias de rumiantes. En el mismo se encontrara material original fruto de investigaciones propias realizadas en el Area Genetica de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de la Republica (UdeLAR) y en el laboratorio de Citogenetica y Genetica Molecular de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza-España (UNIZAR).

A traves de los links que se encuentran en este blog se podran dirigir a web de creacion propia donde encontraran material electronico (articulos cientificos y de divulgacion) para descargar y una web con links de interes en genetica de animales domesticos.

Este proyecto multimedia es un desafi­o para que se pueda acceder en forma gratuita on line a informacion y bibliografi­a relacionada a la tematica de la genetica animal en forma rapida.

La informacion y fotografias son el producto de años de investigacion por lo cual son originales y con derechos reservados . La autora

Historia de la caracterización citogenética en bovinos

La caracterización citogenética en bovinos fue objeto de estudio desde el siglo pasado. Los primeros trabajos se realizaron sobre material testicular de toro (espermatogénesis). La primera comunicación se efectuó en el año 1892 por Von Bardeleben, donde encuentra un número cromosómico de 2n=16. En 1902, Schoenfeld propone un 2n entre 20 y 25 y en 1913, Van Hoof encuentra un 2n entre 20 y 24. En 1919, Masui propone un número cromosómico de 2n=33, y una relación XO para la determinación cromosómica del sexo (Eldridge, 1985). Wodsedalek en el año 1920 realiza estudios en testículo y ovario encontrando 37 cromosomas en espermatogonias y 38 cromosomas en oogonias, concluyendo que los machos presentaban una relación cromosómica sexual XO mientras que las hembras se presentaban como XX. Durante los años 1927 y 1931, Krallinger describe por primera vez el número diploide que hoy caracteriza a esta especie (Hembras (F) 2n=60, XX, Machos (M) 2n=60, XY). Entre los años 1943 al 1944, Makino, verifica el número diploide 2n=60, indicando que no existen diferencias en el número y mecanismo cromosómico de determinación sexual entre especies del mismo género como lo son Bos taurus taurus y Bos taurus indicus.
Hasta el año 1952 el material era procesado por los métodos clásicos de fijación, inclusión en bloques de parafina y tinción con anilinas. A partir de este año, Makino y Nishimura proponen una nueva técnica que sustituye a la clásica por ser más rápida, simple y eficiente. Esta consiste en tratamientos del material con baños de agua, y varias etapas de fijación con distintas soluciones de ácido acético, para una posterior tinción con fucsina y aplastado del material.
A partir de la década del 60 con el mejoramiento de las técnicas de cultivo linfocitario para obtención de cromosomas metafásicos humanos diversos autores comienzan a introducir modificaciones para adecuar estos métodos al cultivo de células de bovinos (Halnan, 1989). El esclarecimiento completo de la morfología cromosómica del Bos taurus se consolida cuando se utiliza como material de estudio los siguientes tipos celulares: médula ósea, fibroblastos y linfocitos quedando establecido el número y morfología cromosómica en 2n=60. Este está constituido por 29 pares de cromosomas acrocéntricos y un par sexual de morfología submetacéntrica, con un X de gran tamaño y un Y de pequeño tamaño. Jorge (1974), realiza estudios citogenéticos comparativos entre razas pertenecientes a Bos taurus taurus y Bos taurus indicus, encontrando una morfología acrocéntrica del cromosoma Y en esta última subespecie.
El advenimiento de las técnicas de bandeamiento cromosómico, permitió una mejor identificación de los pares de homólogos, realizando así un análisis más profundo de su estructura y del cariotipo. El primer paso en bandeo cromosómico bovino fue dado por Hansen (1972) con el empleo de un fluorocromo, la mostaza de quinacrina (bandas Q). Casi simultáneamente se introducen las técnicas de bandeo C (Hansen, 1973; Popescu, 1973, 1975) y de bandeo G (Schnedl y Czaker, 1974). En el año 1976 se realiza la primer Conferencia Internacional para la estandarización de los bandeos cromosómicos en animales domésticos. En la misma se logra la estandarización para las bandas G del Bos taurus taurus, llamando la atención la gran banda clara (G -) central encontrada en el brazo largo (q) del cromosoma sexual X. Esta banda divide a dicho brazo en dos partes, encontrándose en cada una de éstas, dos o más bandas oscuras (G+) (Ford et al. 1980; Gustavsson, 1980).
En el año 1982, Di Berardino y Ianuzzi, realizan la descripción detallada del bandeo R en Bos taurus utilizando la incorporación tardía a los cultivos linfocitarios de 5'bromodeoxiuridina (BrdU), con posterior tinción con naranja de acridina, técnica conocida como bandeo RBA. Mediante este bandeo se estableció que el brazo q del cromosoma sexual X presentaba una prominente banda negativa de localización proximal al centrómero seguida de tres bandas brillantes positivas de localización central. Estos autores proponen la posibilidad de estándarización del bandeo R y su uso rutinario ya que presenta ciertas ventajas con respecto al bandeo G en relación a la distinción entre los cromosomas 4-6-9, 17-18, 22-23, y 24-25-27.
Di Berardino et al. (1985) presentan un patrón de bandeo RBA de alta resolución en cromosomas de Bos taurus, utilizando timidina o metotrexato para la sincronización de cultivos linfocitarios con incorporación tardía de BrdU. Con la sincronización celular obtuvieron un alto porcentaje de células en estados prometafásicos o en etapas metafásicas tempranas, apareciendo los cromosomas más elongados. Con esta técnica, se logra aumentar un 50% el número total de bandas observadas anteriormente. Mientras en el año 1982, Di Berardino y Iannuzzi detectaron un total de 351 bandas R (sumatoria de las bandas positivas y negativas), en 1985 utilizando técnicas de alta resolución se logra observar un total de 521 bandas. Cuando comparan con el estándar para bandeo G de 310 bandas, (Ford et al. 1980) el incremento se eleva un 70%. En el año 1989 se realiza la Segunda Conferencia Internacional para Estándarización de Cariotipos de Animales Domésticos, en la cual se estándarizan 410 bandas G (bandeo GTG) y 404 bandas R (bandeo RBA). El brazo q del cromosoma X queda dividido en cuatro regiones con 17 bandas G y 18 bandas R respectivamente. En cuanto al bandeo G se establece, una gran banda central negativa (3. 1); cuatro bandas positivas en la parte proximal del Xq (1. 2, 2. 2, 2. 4, 2. 6) y cuatro bandas positivas en la parte distal del Xq (3. 2, 3. 4, 3. 6, 4. 2), apareciendo el telómero como G negativo. Mediante el bandeo R, los autores establecen un grupo de tres bandas positivas (2. 5, 3. 1, 3. 3) en el centro del Xq, una larga banda negativa (2. 4) por encima del grupo anterior, y dos bandas negativas (3. 4, 3. 6) separadas por una pequeña banda positiva (3. 5), en la parte terminal, dos bandas positivas (4. 1, 4. 31) con un telómero negativo. En el año 2000 la Internacional System for Chromosome Nomenclatura of Domestic Bovids (ISCNDB) establece un idiograma estandarizado para el bovino con banda RBG y GTG. A nivel del cromosoma X este idiograma establece un total de 25 bandas RBG ( 12 R+ y 13 R-).
En Uruguay los primeros trabajos en citogenética de bovinos fueron realizados en 1956 por Postiglioni y Rossi utilizando como material, testículos de toro (Bos taurus). Dichos autores realizan un profundo estudio sobre la espermatogénesis de esta especie utilizando técnicas de aplastado y de inclusión, confirmando con los estudios cromosómicos de metafases goniales, el número cromosómico 2n=60. Posteriormente mediante la aplicación de técnicas de cultivo linfocitario, Vargas et al. (1987) realizan el estudio citogenético de un bovino seudohermafrodita masculino de la raza Holando Uruguayo que presentaba un cariotipo 60, XX/60, XY. Los primeros trabajos citogenéticos en hembras de bovinos Holando-Uruguayo comienzan a llevarse a cabo en el Laboratorio de Citogenética de Animales Domésticos de la Facultad de Veterinaria de Uruguay, en el año 1988 por Postiglioni y Llambí registrándose cariotipos obtenidos de cultivos linfocitarios.

Cariotipo Bovino

Cariotipo normal con banda RBG de una hembra Holando-Uruguayo (Holstein-Friesian).

29 pares de autosomas de morfología acrocéntrica y un par sexual X (morfología submetacéntrico).

Freemartinismo en bovinos

En la foto observamos dos terneras Holando freemartins con la vellosidad seudoprepucial característica.



Quimerismo XX/XY (Síndrome de Freemartinismo en bovinos).
La frecuencia de partos dobles en bovinos (mellizos) varía de acuerdo a la raza y a los rodeos. Estudios realizados en 16 razas bovinas estiman un rango de frecuencia entre el 0. 51% al 5. 62%. En razas de carne la frecuencia se estima en un 1% mientras que en ganado de leche sería del 4-5%. De ellos se estima que un 95% son mellizos dicigóticos, mientras que un 5% serían gemelos monocigóticos. Los partos múltiples (trillizos, cuatrillizos, etc.) son poco frecuentes. En la raza Friesian Israelí, cuando se estudian rodeos pequeños (nº total de animales = 35. 486) se observa un 3. 91% de partos dobles, mientras que cuando se estudian rodeos grandes (nº total de animales = 105. 597) se observa un 5. 62%, encontrándose una dependencia entre el tamaño del rodeo y el porcentaje de mellizos (David, 1976; Hámori, 1983). En bovinos el desarrollo simultáneo de dos o más embriones en el útero materno posibilita la fusión de las membranas fetales con formación de anastomosis vasculares a nivel del alanto-córion. Dichas anastomosis permiten intercambiar en forma bidireccional elementos formes (células) y sustancias humorales (hormonas) entre los fetos. De acuerdo a la revisión realizada por Romagnano et al. (1988) la ocurrencia de fusiones alanto-coriónicas se estiman en un 92% de los casos, dando lugar a uno de los intersexos gonadales más comunes en bovinos; las llamadas hembras Freemartin. Por lo tanto, podemos definir una hembra Freemartin como un animal estéril nacido mellizo de por lo menos un M (intersexo gonadal). Fenotípicamente en los primeros meses de vida, la apariencia y los genitales externos de una freemartin indican sexo femenino. En algunos casos puede presentarse un abundante penacho piloso en el vértice de la comisura vulvar como signo masculinizante (pilosidad seudoprepucial) (Grunert y Berchtold, 1988). A nivel de los órganos reproductores internos se observan distintos grados de subdesarrollo (vaginas ciegas, ovarios hipoplásicos, agenesia total o parcial de cuernos uterinos, etc.) o bien puede observarse desarrollo de órganos reproductores masculinos (epidídimos, vesículas seminales, tejido testicular, etc.) (Wilkes et al., , 1981). A medida que la edad de estas hembras aumenta, se puede observar un cambio conformacional del cuerpo que la lleva a presentar aspecto de macho (características externas:tabla del cuello ancha, predominancia del diámetro torácico sobre el abdominal, escaso desarrollo mamario, etc.). En esta etapa el clítoris puede hipertrofiarse llegando a adquirir el tamaño y la forma de un pequeño pene (Bonnevaux y Baptista, 1982; Grunert y Berchtold, 1988). Desde el punto de vista etimológico la palabra Freemartin deriva del inglés: a) "Free" que se refiere a una hembra estéril, no lactante, ni preñada con características de toro o buey; b) "Martin", referido al 11 de noviembre (día de San Martin) en el cual se sacrifican entre otros, animales con problemas reproductivos, almacenándose dicha carne para la temporada de invierno (Forbes, 1946). La primera evidencia anatómica de una hembra Freemartin es presentada por Valsalva y Baglivi en el año 1692 (citado por Marcum, 1974). En 1779, John Hunter realiza el estudio detallado del aparato reproductor de tres animales a los cuales considera freemartin, asociando por primera vez la patología encontrada en dichas hembras con el hecho de ser mellizas de machos. Scarpa (1784) describe al freemartin como un animal con órganos reproductores internos exclusivamente masculinos y órganos reproductores externos exclusivamente femeninos.Posteriormente Numan (1843) realiza un exhaustivo trabajo donde considera a los freemartin como M o H con órganos reproductivos defectuosos, no considerándolos como hermafroditas. Por otro lado Monell (1846) y Spiegelberg (1861) encuentran parejas de mellizos heterocigotas donde la H se presenta normal desde el punto de vista reproductivo. Es a principios del presente siglo donde estudios más profundos comienzan a responder interrogantes sobre este fenómeno biológico. En 1911, Tandler y Keller estudian las membranas placentarias de 17 pares de mellizos heterosexuales (H/M) encontrando: a) un corion común entre los mellizos; b) presencia de anastomosis vasculares reveladas mediante inyección de sustancias en la arteria umbilical de uno de los fetos y pasaje de las mismas al mellizo; c) ausencia de anastomosis vascular en un caso donde la pareja de mellizos (H/M) presentaba desarrollo normal de los aparatos reproductores; d) presencia de dos cuerpos lúteos en los ovarios maternos, indicando la condición dicigótica de los mellizos. Entre los años 1916 y 1917, Lillie examina 55 pares de mellizos "in utero", y los ovarios correspondientes encontrando la presencia de dos cuerpos lúteos, apoyando de esta manera la condición dicigótica de los mellizos. Dicho investigador observa la presencia de anastomosis vasculares entre los fetos cuando el tamaño de los mismos se encuentra entre los 19 y 20 mm. Realizando cortes histológicos de los órganos de fetos, cuando éstos tienen un tamaño de 7. 5 a 28 cm observa que el desarrollo de los conductos de Wolff se ve favorecido, mientras que el de los conductos de Muller se ve inhibido. De sus estudios concluye que un Freemartin es una hembra genética que sufre modificaciones en su organismo por hormonas sexuales aportadas tempranamente por el mellizo macho; sugiriendo el pasaje de las mismas a través de la circulación vascular común durante la vida fetal (teoría hormonal). Por otro lado, Chapin (1917) realiza un estudio microscópico del aparato reproductor de varios fetos freemartin llegando a la conclusión que los órganos que se encuentran en estado indiferenciado en el freemartin, van a desarrollarse hacia un estado masculino debido al estímulo de las secreciones hormonales del co-mellizo M, mientras que aquellos órganos que habían comenzado su diferenciación normal como órganos femeninos van a verse retrasados o inhibidos en su desarrollo. Dicha autora propone que la variación encontrada en el desarrollo o tipo de órganos del freemartin va a estar correlacionada con el grado de anastomosis existente así como con el tiempo, en días, en el cual la secreción hormonal del co-mellizo va a entrar en la circulación de la H. Los estudios realizados por Tandler y Keller (1911), Lillie (1916, 1917) y Chapin (1917) permiten descartar la hipótesis propuesta por Hart (1909, 1912) en la cual expresa que un Freemartin es un macho con anormalidades del tracto reproductor, nacido mellizo en condición monocigótica (Marcum, 1974). El intercambio de sustancias hormonales y células mediados por las anastomosis vasculares entre fetos va a traer aparejado la llamada "teoría celular del síndrome de freemartinismo". Esta teoría comienza a gestarse en el año 1945 con las investigaciones realizadas por Owen (1945) sobre tipificación de antígenos eritrocitarios de membrana. Dicho autor, encuentra una relación fenotípica similar en las parejas de mellizos debida al quimerismo eritrocitario. Se entiende por quimera celular aquel individuo que presenta poblaciones celulares distintas provenientes de cigotos diferentes (Chu et al., 1964). Esta teoría celular es reafirmada con los trabajos realizados por Ohno et al., ( 1962, 1965) que comprueban la presencia de quimerismo de los cromosomas sexuales en diversos tejidos y órganos (tejido gonadal, médula ósea, hígado) de los freemartins y sus co-mellizos, en la raza Holstein-Friesian. Además, observan quimerismo XX/XY en células de la línea germinal de testículos de toros co-mellizos y a nivel de las células precursoras sanguíneas de ambos mellizos. Estos investigadores realizan uno de los primeros análisis del número de placas metafásicas de células XX/XY, encontrando que el libre intercambio de células precursoras sanguíneas no se realizaba en la proporción esperada 1:1 (entre células donantes y células húesped), dentro de cada pareja de mellizos. En 1962 la teoría célular sufre un quebranto con las investigaciones de Makino et al., ya que ellos no encuentran quimerismo XX/XY al realizar estudios citogenéticos en freemartins mediante la técnica de cultivo de leucocitos y cultivo de células de pulmón. A partir del año 1963, los trabajos de Fechheimer et al. confirman que los freemartins y co-mellizos son quimeras celulares XX/XY, postulando que la condición de intersexo está directamente relacionada con la presencia del cromosoma Y en la etapa fetal del desarrollo de la H. En 1965, Makino et al. amplían los estudios realizados en 1962, y encuentran quimerismo XX/XY en tejidos derivados del mesodermo y del endodermo. Estos estudios son complementados por Muramoto et al. (1965) encontrando quimerismo en 6 pares de mellizos heterosexuales. Los tejidos analizados por dichos autores fueron sangre, gónadas, riñon e hígado (de origen mesodérmico), pulmón (origen endodérmico) y piel (origen ectodérmico). En este último tejido no encuentran quimerismo XX/XY. Ellos observan que dentro de cada pareja de mellizos existe una gran variación en cuanto a la proporción de células quiméricas según los tejidos analizados. A mediados de la década del 60 y durante la década del 70 numerosos grupos investigan el quimerismo leucocitario XX/XY en las parejas de mellizos heterosexuales encontrando un paralelismo entre los porcentajes de células XY de las freemartins con respecto a los co-mellizos (Basrur y Kanagawa., 1969; Darré et al., 1972 ; Jost et al.,1972). Marcum et al. (1972) realizan un análisis estadístico de dicho paralelismo encontrando una alta correlación positiva (r=0. 97) entre el porcentaje de células XY de H quiméricas con el porcentaje de células XY de los M co-mellizos de éstas. Esto quiere decir que si una H freemartin presenta un 25 % de células XY en cultivos leucocitarios, el M co-mellizo presentará también un 25 % de células XY (Eldridge, 1985). Por otro lado, Wilkes et al. (1981) estudian la distribución de células XY en cultivos linfocitarios de 19 pares de mellizos heterosexuales y los relacionan con 117 casos citados en la literatura, encontrando una distribución azarosa del porcentaje de células XY, en un rango entre el 2% a un 96%. Estos autores discuten la importancia de dicha distribución en lo que hace al diagnóstico citogenético, ya que una H freemartin con bajo porcentaje de células XY es tan infértil e improductiva como una freemartin con alto porcentaje de células XY. También realizan cultivos celulares de distintos órganos (gónadas, pulmón, bazo, piel, riñón) y, de 41 cultivos, encuentran en 8 la presencia de quimerismo XX/XY (en bazo, gónadas y pulmón) con un rango del 2%. Estas diferencias entre la variación del quimerismo celular según el órgano o tejido, la explican como una posible contaminación de células leucocitarias en los cultivos mencionados. Esto trae como consecuencia la revisión en cuanto a si un freemartin y co-mellizo son quimeras secundarias (quimerismo celular en uno o pocos tejidos del cuerpo) o si son quimeras primarias (quimerismo en todas las células del cuerpo) (Wilkes et al., 1981).




En la foto observamos el quimerismo (células XX/XY) en un cultivo de linfocitos de una hembra fremartin.

La evidencia de células de la línea germinal XX a nivel de testículo (Ohno et al., 1962) trajo aparejado una serie de trabajos donde se discuten por un lado la fertilidad de los toros co-mellizos de H, y por otro la posible desviación de la proporción sexual 1:1 en la descendencia de dichos M. Esta última se vería favorecida hacia una progenie con mayor número de H. Como consecuencia de los estudios mencionados se propusieron dos hipótesis: 1) las células germinales XX localizadas en los testículos del toro, favorecerían un exceso de producción de espermatozoides portadores de cromosoma sexual X y por ende una desviación de la proporción sexual, con un mayor número de hembras en la progenie; 2) las células germinales localizadas en los testículos no serían viables puesto que degenerarían y por ende la fertilidad de los machos se vería reducida (Long, 1979). En cuanto a la primer hipótesis, estudios poblacionales realizados en centros de inseminación artificial donde se utilizaron toros quiméricos no revelaron la existencia de una desviación significativa de la proporción sexual 1:1 en la progenie de los mismos (Gustavsson, 1977; Kosaka et al., 1969). A pesar de estos estudios otros investigadores han reportado en forma individual, casos en los cuales toros quiméricos producían un exceso de H en su progenie (Dunn et al., 1968 ; Giovanni y Molteni , 1976). En cuanto a la segunda hipótesis, existen trabajos poblacionales en los cuales se evalúa la fertilidad de toros quiméricos en función de la calidad seminal y parámetros reproductivos, no encontrándose diferencias significativas en cuanto a fertilidad cuando se comparan con toros nacidos de parto único (Gustavsson, 1977; Valle-Filho et al., 1983). Estos resultados se contraponen con los encontrados por Dunn et al. (1979) cuando, estudiando la calidad seminal y performance reproductiva de 12 toros quiméricos encuentran que 7 (58. 3%) de ellos presentaban baja performance reproductiva así como focos de degeneración testicular. En los últimos años, las técnicas de la biología molecular como la utilización de marcadores genéticos hipervariables (fingerprinting) y la amplificación de secuencias nucleotídicas mediante la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) han permitido profundizar en el estudio de la teoría celular del freemartinismo. La utilización de sondas como: pÓ3'HVR64, pINS310, pEFD134. 7, pSRC-7 han permitido comprobar la presencia de quimerismo en muestras de ADN sanguíneo de ambos mellizos dicigóticos (igual patrón de bandas de fingerprinting). Estas mismas sondas aplicadas sobre ADN extraído de biopsias de piel de las mismas parejas pudo evidenciar patrones distintos de fingerprinting para cada integrante de la pareja. Estos resultados estarían apoyando la teoría celular de quimerismo secundario . Dicha teoría propone que el quimerismo se establece sólo a nivel sanguíneo, mientras que en otros tejidos del organismo cada integrante de la pareja presenta su genotipo real (Grobet et al., 1991; Plante et al., 1992). El dimorfismo sexual en mamíferos tiene su base genética en la constitución de los cromosomas sexuales X e Y. El cromosoma Y representa un 0. 5% del genoma diploide del bovino ( 7 X 10 9 bp) (Matthews y Reed, 1991). La utilización de secuencias específicas del cromosoma Y así como secuencias nucleotídicas de los cromosomas sexuales X/Y han permitido identificar la presencia de quimerismo s y aneuploidías de los cromosomas sexuales. En humanos, Mutter et al. (1991) mediante la utilización de la técnica de PCR han podido cuantificar genes como el ZFX/ZFY que se encuentran ligados en los cromosomas sexuales X e Y. Esta cuantificación ha llevado a la identificación de desbalances de los cromosomas sexuales permitiendo complementar la información obtenida por las técnicas convencionales de citogenética. Mediante la técnica de PCR, Aasen y Medrano (1990) lograron la amplificación en bovinos de los genes ZFX/ZFY. Estos productos de amplificación mostraron un polimorfismo en el largo de los fragmentos de restricción (RFLP) pudiéndose identificar el gen ZFX del ZFY. Por otro lado, Setiabudi (1993), utilizando el juego de primers BRY. 1, consigue amplificar un segmento nucleotídico específico del cromosoma Y bovino de 307 pb de ADN extraído a partir de muestras sanguíneas de 9 H freemartin.




En la foto se observa el gel de agarosa con el resultado del diagnóstico por PCR en muestras de ADN extraídas de sangre de hembras freemartins y sus comellizos machos.en el carril B y E se observa la banda de 307 pb como resultado positivo de que estas hembras son químeras y tienen secuencias del cromosoma Y ,en el carril D el resultado es negativo ya que se trata de una muestra de ADN de una hembra fértil y normal (madre de las parejas de mellizos), los carriles C y F corresponden a muestras de ADN de los machos mellizos, el carril G es un control negativo y en A y H tenemos marcadores de peso molecular.

Hipospadia en Ovinos

Podemos decir que esta patología se caracteriza por una malformación en el tracto genito-urinario.

Desde el punto de vista genético se clasifica como un intersexo fenotípico (gonadas y cariotipo de un sexo , en este caso sexo masculino y apariencia intersexuada feminino-masculino).

El presente caso corresponde a un animal de la raza corriedale que presentaba testículos y un cariotipo normal con un par cromosómico XY (2n=54,XY).

En humanos se ha visto que mutaciones en el gen receptor de andrógenos AR (sustituciones, inserción de codones stop) producen este tipo de malformación.

En la imagen se observa la parte posterior del animal donde la malformación de la uretra le da un aspecto de seudovulva entre la bolsa escrotal. La lana de la región se encuentra manchada de orina debido al mal cierre de la uretra (animal de aspecto intersexuado).

Cariotipo del animal con morfología cromosómica y número normal de cariotipo de macho (2n=54, XY).

Imagen de la región peneana donde se observa la malformación de la uretra.

Marcadores Moleculares de ADN y Sanidad de Bovinos de leche

MARCADORES MOLECULARES DE ADN Y SU APLICACIÓN EN SANIDAD DE RODEOS LECHEROS

Resumen

El conocimiento del genoma bovino y la utilización de marcadores de ADN ha permitido conocer el origen de determinadas enfermedades hereditarias y desarrollar técnicas de diagnostico precoz.
Mediante el aislamiento de ADN a partir de muestras de sangre, semen, pelo, etc. y aplicando técnicas de PCR-RFLP (amplificación y cortes con enzimas de restricción específicos de secuencias de ADN) podemos diagnosticar si un animal es portador de un gen letal o mutante para determinadas características. En la actualidad podemos estudiar enfermedades hereditarias del bovino de leche como: BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina) que produce mortalidad en terneros por una baja de inmunidad, DUMPs (deficiencia de la enzima uridina-monofostato sintasa) que produce una disminución en la tasa de no retorno al servicio por mortalidad embrionaria, Citrulinemia bovina (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa) que produce mortalidad en terneros con sintomatología de depresión de sistema nervioso, CVM (complejo vertebral de malformación), pie de mula, carácter bulldog, hernia umbilical, etc. En el laboratorio del Área Genética de la Facultad de Veterinaria nos encontramos desarrollando un Proyecto en el que uno de sus objetivos plantea el estudio de enfermedades monogénicas en bovinos de la raza Holando-Uruguayo. Dentro de las enfermedades hereditarias estudiadas por técnicas de ADN en nuestro País hemos detectado la presencia del gen mutante para la enfermedad BLAD en reproductores de esta raza. Si bien la frecuencia de estos genes mutantes es baja, debemos tener en cuenta que la utilización masiva de determinados reproductores portadores puede incrementarla y así generar importantes perdidas económicas. Por otro lado el conocer si un reproductor esta libre de una enfermedad hereditaria permite desde el punto de vista económico generar un valor agregado a su producto (semen, embriones). Por estos motivos en diversos países se han implementado programas de vigilancia para enfermedades genéticas; de aquí la importancia de divulgar a los colegas veterinarios y productores la utilización e importancia de los marcadores moleculares de ADN en sanidad animal.

Introducción
En la década pasada los avances tecnológicos ocurridos en el campo de la genética molecular y la informática (bioinformática, bancos de genes de dominio publico) han permitido la identificación de genes relacionados con desordenes hereditarios de importancia en el ganado lechero. En la mayoría de los casos la presencia de mutaciones simples en estos genes produce la formación de variantes proteicas no funcionales ocasionando importantes alteraciones en el desarrollo y metabolismo de los animales. En este tipo de alteraciones los animales portadores de variantes génicas mutadas no presentan alteraciones pero si las trasmiten a su descendencia aumentando de esa forma la probabilidad del desarrollo de enfermedades hereditarias con repercusión en el ámbito económico. Debemos tener en cuenta que un toro elite seleccionado como reproductor puede llegar a tener mediante las técnicas de reproducción asistida una descendencia estimada de 10.000 hijos y 100.000 nietos, de aquí se desprende la importancia del control de enfermedades hereditarias.
Las estrategias para él diagnostico genético se pueden clasificar en dos grupos: directas e indirectas. En las directas el marcador molecular utilizado puede ser la identificación de la mutación en el gen asociado a la patología.
Los protocolos de diagnostico directo comprenden los siguientes pasos:
- Extracción de ADN a partir de muestras biológicas (sangre extraída con anticoagulante, semen, tejidos, leche, etc.),
- amplificación (por técnica de PCR) de la secuencia de ADN que contiene el sitio donde ocurre la mutación,
- tratamiento de la secuencia amplificada con la enzima de restricción que cortan la secuencia normal (RFLP)
- electroforesis en geles de agarosa para observación del numero y tamaño de los fragmentos de ADN,
- análisis y genotipado para determinar si el animal es normal, portador o afectado.
El diagnóstico indirecto es independiente del conocimiento del gen implicado en la patología y se fundamenta en la herencia conjunta o estrechamente ligada del marcador molecular de ADN con el gen de interés. En estos casos el marcador molecular puede ser una secuencia repetida polimórfica (microsatélite) realizándose el estudio de cosegregaciòn entre la patología y dicho marcador.
El desarrollo de los mapas genéticos comparativos entre especies ha permitido avanzar en el conocimiento de patologías en mamíferos. En el presente año un total de 1564 genes y secuencias que se expresan (marcadores tipo I) y 349 microsatélites (marcadores tipo II) han sido mapeados en el bovino. La rapidez con que avanza la tecnología genética en este campo ha permitido a investigadores norteamericanos anunciar y difundir la secuenciación completa del genoma de un bovino de raza Hereford.

Enfermedades hereditarias de interés en bovinos de leche:

DUMPS (deficiencia de la enzima uridina-monofostato sintasa): enfermedad hereditaria metabólica que contribuye a aumentar la tasa de retorno al servicio estando dentro de las causas hereditarias del síndrome vaca repetidora de servicio. El gen que codifica para esta enzima se encuentra mapeado en el cromosoma BTA1 del bovino y el cambio de una base nucleotidica (C-T) produce un alelo mutado que genera un codòn stop con terminación prematura de la cadena polipeptídica. Los embriones que heredan los dos alelos mutados carecen de esta enzima y no pueden seguir con su desarrollo normal. Los ancestros identificados como portadores de la enfermedad provienen de dos líneas: Toro Happy-Herd Beautician y Needle-Lane Jon Red.
BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina): enfermedad hereditaria que contribuye a aumentar la tasa de mortalidad en terneros. Estos mueren entre los 2 a 8 meses de vida con sintomatología clínica inespecífica (enteritis, falta de cicatrización de heridas, neumonías, estomatitis ulcerativas, etc. Existe una baja en las defensas inmunitarias producto de una mutación puntual en el gen CD18. En nuestro País utilizando él diagnostico con marcadores de ADN sobre una muestra de 138 bovinos Holando se encontró que el 7.2% eran portadores de esta patología.
CITRULINEMIA (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa): Enfermedad recesiva letal metabólica en la cual la falta de esta enzima en doble dosis produce la muerte de los terneros (durante la primer semana de vida) con sintomatología clínica de intoxicación por hiperamonemia y depresión del sistema nervioso. Uno de los toros portadores y diseminadores en la raza Holstein es Linmack Kriss King. El gen que codifica para esta enzima se encuentra mapeado en el cromosoma BTA11 y dicha patología se genera por la presencia de una mutación puntual permitiendo diseñar un diagnostico molecular directo por PCR-RFLP.

En la Figura vemos un gel de agarosa donde en animales homocigotas dominantes (normales) se observan dos bandas despues de realizar el corte con la enzima de restricción (1,2,3,4 color amarillo).

CVM (Complejo de malformación vertebral): Patología hereditaria que se manifiesta con abortos y nacimiento de terneros prematuros (antes del día 260) con alteraciones importantes del desarrollo a nivel de columna vertebral, miembros, malformaciones del tracto digestivo y corazón.
Se observan terneros con fusiones de vértebras, flexión de carpo, enanismo proporcionado.
En este tipo de enfermedades autosómicas recesivas si se cruza un toro portador con una hembra portadora obtenemos el 75% de la progenie normal (25% normal y 50% normal portadora) y un 25% enferma. El estudio de pedigríes permitió conocer que dicha mutación se origino en un toro que es el mismo que trasmitió el BLAD a nivel mundial (7H0543 Carlin-M Ivanhoe Bell BL). Otros reproductores que han contribuido a la diseminación de esta patología son: 7H02236 Emprise Bell Elton BL y Southwind Bell of Bar Lee. El diagnóstico molecular para esta enfermedad se encuentra patentado en Europa y Estados Unidos por laboratorios privados.

Simbología utilizada en los catálogos de reproductores
Enfermedad hereditaria
BL- Portador de BLAD
TL- Libre de BLAD
CV- Portador CVM
TV- Libre de CVM
DP- Portador de DUMPS
TD- Libre de DUMPS
BD- Portador del gen Bulldog
MF- Portador de Pie de mula

BIBLIOGRAFÍA
-Everts-van der Wind, A; et al. (2004). A 1463 Gene cattle-human comparative map with anchor points defined by human genome sequence coordinate. Genome Reseach 14: 1424-1497 (www.genome.org).
-Llambi, S y Arruga. (2002). Genes, cromosomas y fertilidad en bovinos. Albéitar. 60:36-39 (Publicación para veterinarios y técnicos del sector de animales de producción, España).
-Llambì, S et al. (2003). Frequencia da deficiencia na adesao leucocitaria em uma populacao de bovinos da raca holandesa, no Uruguai. ARS VETERINARIA, Vol. 19, Nº1:52-56.
-Rincón, G. (2002). Aplicación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en sanidad, producción y reproducción animal. 41-48. Curso Posgrado Veterinaria-Pedeciba. Facultad de Veterinaria-UdelaR. Dep. Legal 328831.

Direcciones de Internet
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/
http://www.cgd.csiro.au/
http://www.genome.gov/12512900
http://www.holsteinusa.com/
http://www.holsteinworld.com/

Conferencia presentada en Seminario "Leche y Productos lácteos aspectos moleculares y tecnológicos" 4-5 Noviembre 2004- Facultad de Agronomía-UdeLAR-Uruguay

Enfermedad BLAD

Deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina (BLAD).

La deficiencia en la adhesión leucocitaria (LAD) ha sido descrita en humanos dentro de las granulocitopatías con reducción de la producción de la ß2 integrina teniendo un origen hereditario (Eskra et al. 1991). En bovinos, el BLAD se describió en el año 1994 por Muller et al., determinándose como una enfermedad autosómica recesiva en la cual los animales homocigotas recesivos mueren a los pocos meses de nacer (2 a 8 meses) con una sintomatología clínica inespecífica. Al nacimiento los terneros afectados son aparentemente sanos pero a las pocas semanas comienzan síntomas de: fiebre alta, diarrea crónica, falta de cicatrización de heridas, gingivitis e infecciones generalizadas. Estas terminan con la muerte del animal, no respondiendo a terapia antibiótica. La enfermedad ha sido también descrita en perros de la raza Setter Irlandés (Trowald-Wigh et al. 1992). En humanos se designa como Leukocyte Adhesión Deficiency (LAD). Esta se comporta como monogénica autosómica recesiva y es causada por la falta o ausencia parcial de una familia de integrinas leucocitarias (Mac-1, LFA-1 y p150,95). Los niños afectados desarrollan infecciones bacterianas recurrentes con leucocitosis persistente. Estos pacientes sin un transplante de médula ósea mueren a temprana edad (Eskra et al. 1991).
A nivel molecular se observó una mutación puntual en el gen CD18 que codifica para una subunidad a proteíca que forma parte del complejo Mac-1 (CD11/CD18) y que a su vez integra el complejo mayor ß2 integrina. Los neutrófilos al presentar la deficiencia de la ß2 integrina estan impedidos de adherirse a los receptores de membranas de los vasos sanguíneos no realizando la diapedesis y la defensa extravascular.
Mediante la secuenciación del ADNc del gen CD18 se pudieron identificar dos mutaciones puntuales cuando se analizaron muestras de bovinos sanos y bovinos enfermos de BLAD.
Una de esas mutaciones es silenciosa y se localizó en la base 775 (CèT) y a nivel proteico el aminoácido que se conserva es la Leucina. La otra mutación que da origen al alelo afectado se produce en el cuarto exón del gen CD18 (Mutación puntual AèG, nucleótido 383), cambiando el Ac.aspártico por la Glicina en la posición 128 de la secuencia protéica, (D128G). Este cambio aminoacídico se realiza en una región altamente conservada del dominio extracelular de la glicoproteína CD18 por lo que se generan dos formas alélicas: D128/D128 (normales); D128G/D128 (portadores heterocigotas) y D128G/D128G (afectados) con lo cual el alelo normal es dominante frente al alelo mutante (Kehrli et al. 1990).
En el año 1992, Shuster et al. desarrollan un método de diagnóstico para detectar animales portadores del alelo afectado mediante la técnica de PCR, amplificando un fragmento del gen CD18 que contiene la zona de la mutación. Posteriormente mediante la utilización de endonucleasas de restricción (E.R) es posible distinguir el RFLP (polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción) entre el alelo afectado y el alelo normal, debido a que la mutación provoca la perdida de un sitio Taq I y en su lugar se produce un sitio específico HaeIII.

Esquema de la estrategia de PCR/RFLP para el diagnóstico de BLAD.

Diagnostico de BLAD por PCR
Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Calle 1, marcador de peso molecular, calle 2 y 3 animales heterocigotas (bandas de 159, 109 y 50 pb) , calle 4 animal homocigota dominante (bandas de 109 y 50 pb).

El origen y la difusión de esta enfermedad en los Estados Unidos, se debió a la utilización en centros de inseminación artificial de un excelente toro (Carlin M Ivanhoe Bell).
El pedigrí estudiado por Kerhli et al. (1990) donde se describe la mutación a nivel molecular se remonta por vía materna y paterna a un ancestro común (toro Osborndale Ivanhoe), abuelo paterno del toro Carlin M Ivanhoe Bell.
En el año 1996, la Hoard?s Dairyman de USA publica una lista con toros portadores del BLAD entre los 100 mejores toros americanos: Coldsprings Osado, Dixie-Lee Ivanhoe Henry-ET, Ikenotch Bellor Jack, Schutzs Brass Bell, Liss-Cres-View Jess, Thonyma Secret, Bchnc Bell Benjamín, Clov-Hi Marck Astra Bram, Osborndale Ivanhoe, Penstate Ivanhoe Star, Carlin M Ivanhoe Bell.
Schifferli et al. (2000) describen un método rápido y económico para obtención y transporte de ADN utilizando tarjetas FTA desarrollando de esta manera una metodología sencilla para establecer un nexo directo entre los establecimientos lecheros interesados en conocer el genotipo de sus animales y los laboratorios de diagnóstico. El desarrollo de las técnicas de diagnóstico molecular permitió realizar una selección temprana de los reproductores tendiendo a disminuir la frecuencia del alelo mutante. Mukhopadhyaya et al. (2000) describen un método nuevo donde mediante la técnica de PCR-RFLP crean mutaciones ?in vitro? para generar controles positivos de BLAD (homocigotos recesivos y heterocigotos) a partir de ADN de muestras de bovinos normales. Estos controles son necesarios cuando se deben realizar el genotipado de reproductores y cuando la incidencia de la enfermedad es baja muchas veces es dificultoso la obtención de este material genético. La enfermedad BLAD presenta a nivel mundial una distribución y frecuencia variada. En Uruguay la frecuencia del gen mutado BLAD en una muestra de 138 animales estudiados fue de q=0029 con un 7.2% de animales portadores de la mutación.